Оригами объемное схемы: Объемное оригами

Пока двумерные (2D) методы нанопроизводства, такие как электронная лучевая и рентгеновская литография, наноимпринтинг, перьевая литография, и т. д., могут надежно воспроизводить элементы размером менее 20 нм, эти методы отсутствие возможности создавать неплоские узоры, т.е.е. трехмерный (3D) структуры. Использование 3-го измерения позволит устройств, чтобы обеспечить дополнительную гибкость или даже полностью новые функции. Третье измерение также помогает преодолеть связанные задача преодоления разрыва между наноразмерными характеристиками системы и макромасштаба (рис. 1).

Процесс Nanostructured Origami™ преодолевает эту трудность использования 3-го измерения путем заимствования идей из Японское искусство складывания бумаги или оригами. По первому паттерну 2D-мембраны с помощью обычных инструментов литографии, а затем складывание их в произвольную компоновку, почти любая трехмерная форма может быть сформировался. Конечно, каждая из этих складчатых мембран будет иметь был создан на предыдущем шаге с желаемым механическим, электрические, оптические и другие функции (рис. 2 и 3).

Рисунок 1 Преодоление разрыва между наномасштабом и макромасштабом.

(а) (до н.э)
Рисунок 2 (а) Плоское изготовление. (b) Складывание мембраны. (c) Готовое устройство.

В настоящее время мы изучаем два основных метода создания оригами. складывание мембраны: срабатывание силы Лоренца и остаточное напряжение индуцированное скручивание.

В метод действия силы Лоренца, ток подается на сегмент, который должен складываться в присутствии магнитного поля. По закону Лоренца на него действует направленная вверх сила. внешний край сегмента, как показано на рисунке 4.

Другой Схема складывания, которую мы исследуем, относится к нитриду кремния как «бумага.” Области складок сначала литографически определяется, а складывание вызывается осаждением напряженного металла слой поверх нитрида. Мы можем сложить нитрид слой под произвольным углом, регулируя размер складки и управление остаточным напряжением наплавленного металла исполнительный слой.

Рисунок 5 показано изображение, полученное с помощью сканирующего электронного микроскопа (СЭМ), слой сложен за пределы 360o.Радиус кривизны примерно 20 микрон, что примерно равно радиусу человеческого волоса.

Рисунок 6 показан вид сверху на скручивание. Верхний слой хром и выглядит белым под микроскопом. Нижний слой, силикон нитрид, имеет более темный зеленый цвет. Можно наблюдать складывание от внешних углов.

Рис. 4. Сгибание мембраны под действием силы Лоренца

Рис. 5: СЭМ-изображение 360-градусной складки.

Рис. 6: Завивка, вид сверху.

Несколько устройств были успешно изготовлены. Наш первый устройства были изготовлены с использованием кремния в качестве конструкционного материала закрылков и складываются на 180º с помощью вышеупомянутого Метод срабатывания силы Лоренца.Решетки с характеристиками менее 40 нм также были включены в изготовленные устройства. Следующий Поколение устройств использовало полимер под названием SU-8 в качестве структурного элемента. материал. На рис. 8 показано двухстворчатое устройство из СУ-8, которое выскочил из подложки из-за вызванного стрессом схема складывания упоминалась ранее. На рис. 9 показана пирамида. структуры, которые используются для поддержания расстояния и выравнивания между различными складчатыми слоями.На рис. 10 показано устройство после завершения этапа складывания.

Рисунок 7: Интегрированные решетки наноразмерных элементов в складное устройство

Рис. 8: Двухстворчатое устройство после индуцированного частичного складывания
через остаточное напряжение.

(а) (b)
Рисунок 9: (a) Оригами с использованием процесса SU-8.(б) Крупный план вид на пирамиды выравнивания.

Рисунок 10: Изображение сверху двухстворчатого устройства.

Программное обеспечение была разработана для визуализации процесса складывания и моделирование кинематики конструкций оригами. Наша модель начинается путем присоединения замкнутой «каркасной» конструкции к сегменты оригами.Затем скелет разбивается на две части. части и поступательная кинематика выполняются в той части, которая содержит исполнительный механизм. Вторая часть ограничена по условию целостности, поэтому его движение оценивается с помощью инверсной кинематики. Особенности инверсной кинематики второй части свидетельствует о нарушении кинематической целостности в заданной структуре. Кинематическая совместимость обеспечена путем отслеживания краев сегмента (эта функция еще не реализованы в нашем программном инструменте).Графический интерфейс разработанного программное обеспечение показано на рис. 10, а на рис. 11 показан пример процесса визуализации и кинематического моделирования [1].

Рисунок 11: Программное обеспечение, разработанное для визуализации и выполнения кинематики. моделирование процесса складывания.

Рисунок 12: Пятисегментный механизм оригами (последовательность срабатывания показано по часовой стрелке сверху) и углы складывания двух сегментов в ответ на активацию диагонального сустава.

Наноструктурный процесс изготовления и сборки Origami™ был разработан для 3D-нанопроизводства с использованием обычных Инструменты для двумерной литографии. Результаты, представленные выше, показывают большие надежды для этой техники, и мы уже находимся в процессе применения этот метод для изготовления новых трехмерных наноструктурированных устройства, такие как системы накопления энергии и многослойные дифракционные оптические элементы.

НОМЕР:

1. Т. Бюхнер, «Кинематика трехмерных складных структур для наноструктурного оригами», дипломная работа, Лаборатория станков и технологии производства, Рейнско-Вестфальский технический университет Ахена (2004).

НАВЕРХ

Стабильные трехмерные иерархические каркасы с использованием подхода оригами: эффект межфазного сшивания наногибридными сборками шашлыка

Основные моменты

•

Полимерные волокнистые слои, армированные нанонаполнителями, были изготовлены для создания гибких каркасов путем складывания 2D-мата в многослойные стопки с использованием подхода, вдохновленного оригами.

•

Взаимопроникающая сеть гибридных полимерных ламелей была выращена на стыках для улучшения связи между последующими строительными блоками.

•

Стабильность размеров контролировалась по шкале длины для получения высокостабильной иерархической геометрии пор.

Abstract

Трехмерные высокопористые архитектуры с индивидуальной гибкостью и стабильностью размеров в настоящее время являются новой областью благодаря широкому спектру технологических применений. Здесь мы подчеркнули важность механической и термической стабильности строительных блоков и межфазного соединения для разработки таких каркасов. 2D электроформованные отдельно стоящие нановолокнистые маты из полиэтилентерефталата (ПЭТФ) с различной молекулярной массой были использованы для изучения свойств основных блоков основы.Сшитые сети наногибридного шашлыка (NHSK) типа поликапролактона (PCL) были выращены между штабелированным нановолокнистым матом для лучшего связывания между слоями. Углеродные нанотрубки были дополнительно введены в нановолокна ПЭТФ, а также в связующие покровные слои, чтобы понять свойства термической и структурной стабильности. Наличие различных ограниченных одномерных зародышевых поверхностей, таких как нанотрубки и нановолокна, дает нам возможность изучать взаимопроникающие ламели NHSK на разных масштабах длины.Ряд сшитых каркасных микроструктур методом оригами был исследован, чтобы подчеркнуть важность проектирования процесса для изготовления размерно-устойчивых пористых геометрий. (0) Опубликовано Elsevier Ltd.

Рекомендуемые статьи

Ссылающиеся статьи

Трехмерная динамика формы одиночных клеток, ориентированная вдоль апико-базальной оси складчатого эпителия по данным флуоресцентной микроскопии

Цитирование: , Frangi AF (2021)Оригами: динамика трехмерной формы одиночных клеток, ориентированная вдоль апико-базальной оси складчатого эпителия, по данным флуоресцентной микроскопии. PLoS Comput Biol 17(11): е1009063. https://дои.org/10.1371/journal.pcbi.1009063

Редактор: Дина Шнейдман-Духовны, Еврейский университет в Иерусалиме, ИЗРАИЛЬ

Поступила в редакцию: 5 мая 2021 г.; Принято: 13 октября 2021 г .; Опубликовано: 1 ноября 2021 г.

Авторское право: © 2021 Mendonca et al. Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Код можно найти на GitHub: https://github.com/cistib/origami Данные можно найти на FigShare: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.14531421.v1.

Финансирование: Работа была поддержана проектным грантом Исследовательского совета по биотехнологии и биологическим наукам (BBSRC; https://bbsrc.ukri.org/) для TTW, SB и AFF (BB/M01021X/1). Визуализация проводилась в Центре световой микроскопии Вольфсона в Университете Шеффилда при поддержке Исследовательского совета по биотехнологии и биологическим наукам BBSRC ALERT14, присуждаемого TTW и SB за световую микроскопию (BB/M012522/1).AAJ финансировался за счет премии для докторантов от Исследовательского совета по биотехнологии и биологическим наукам BBSRC Партнерство по обучению докторантов White Rose в области механистической биологии (BB / M011151 / 1). AFF поддерживается Кафедрой новых технологий Королевской инженерной академии (CiET1819\19) и сетью MedIAN (EP/N026993/1), финансируемой Исследовательским советом по инженерным и физическим наукам (EPSRC; https://epsrc. ukri). орг/). Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Сложные морфологии различных таксонов и типов тканей возникают в результате деформации эпителиальных пластов [1–3]. У эмбриона многие развивающиеся эпителии образуют сильно изогнутые поверхности. Процессы складывания эпителия управляются поляризованными механическими силами и включают трехмерные изменения формы на клеточном уровне [4,5]. Методы флуоресцентной визуализации позволили проследить такие изменения формы с клеточным разрешением in vivo и в режиме реального времени [6-8].Эти достижения в области визуализации впоследствии привели к разработке инструментов для количественной оценки эпителиальной динамики, особенно изменений формы клеток.

Многие инструменты анализа изображений, измеряющие изменение формы клеток, были ограничены данными двумерной [9–12] или квази-трехмерной флуоресцентной микроскопии [13]. Расширению этих измерений до 3D способствовала разработка основанных на мембранах методов 3D-сегментации, таких как ACME [14], RACE [15], 3DMMS [16], CellProfiler 3.0 [17] и совсем недавно основанных на глубоком обучении. методы [18–21].Некоторые инструменты анализа изображений, такие как CellProfiler 3.0 [17], MorphoGraphX ​​[22] и ShapeMetrics [23], предоставляют конвейеры для вычисления признаков формы клеток, не зависящих от направления. Тем не менее, нахождение положения 3D-сегментированных клеток вдоль биологически значимых осей для количественной оценки характеристик направленной формы все еще остается сложной проблемой, для которой до сих пор не найдено обобщенного решения.

Определение ориентации отдельных клеток относительно известной общей полярности эпителиального слоя имеет решающее значение, поскольку клеточно-поляризованные биомеханические процессы вызывают изменения формы клеток; сужение или расширение может происходить вдоль апикальной [24,25] или базолатеральной [26] клеточной поверхности и может быть обнаружено по любому перекосу в распределении массы внутри клетки вдоль апико-базальной оси симметрии. Складывание эпителия может быть инициировано или находиться под влиянием клеточной пролиферации, гибели клеток, ремоделирования цитоскелета или изменений свойств клеточной поверхности [27,28]. Эти механизмы могут привести к изменениям характеристик формы клеток, включая высоту и ширину клеток, объем, площадь поверхности и сферичность.

Ориентацию или полярность клеток можно определить вдоль плоскости эпителия (плоскостная клеточная полярность) или перпендикулярно плоскости эпителия вдоль апико-базальной оси клетки. Существующие автоматизированные методы определения полярности сегментированных клеток часто полагаются на дополнительные биохимические маркеры полярности [29-31].Включение таких дополнительных маркеров в эксперименты по флуоресцентной визуализации увеличивает время, необходимое для создания каждого изображения, что может привести к фототоксичности, а полученный в результате больший объем данных изображения делает анализ дорогостоящим в вычислительном отношении. Кроме того, производство необходимых животных, несущих несколько трансгенов для живой визуализации, может быть сложным и дорогостоящим. Некоторые методы анализа изображений вычисляют векторы направления для отдельных клеток путем рисования векторов нормалей к полиномиальным функциям, часто эллипсоидам, используемым для оценки поверхности образца — например, целых эмбрионов [15] или бластодерм [32], подвергающихся морфогенезу.Эти методы специфичны для геометрии образца и непригодны для анализа сложных складчатых топологий на продвинутых стадиях морфологического развития. Третий метод использует известные особенности формы клеток для определения ориентации клеток, например, путем применения анализа основных компонентов (PCA) для вычисления апико-базальной оси в столбчатых клетках в EDGE4D [33] и передне-задней оси в зачатках боковой линии рыбок данио. с использованием геометрической морфометрии на основе ориентиров [31] или ориентации клеток вдоль их длинной оси в глазном бокале рыбок данио, как в LongAxis [34].Эти стратегии будут применимы только в том случае, если доминирующая характеристика формы ячейки, например отношение высоты к ширине ячейки, известна и остается неизменной в пространстве и во времени.

Мы представляем новый автоматизированный и простой в использовании инструмент Origami для выделения признаков формы с изменяющимся направлением вдоль апико-базальной оси путем реконструкции поверхности эпителия с использованием треугольной сетки (рис. 1). Origami применяется к широкому диапазону геометрии образцов, подвергающихся морфогенезу, и автоматически извлекает векторы направления для отдельных клеток, выровненных по апико-базальной оси эпителиального листа, не требуя дополнительных меток для полярности.Элементы формы с переменным направлением рассчитываются путем вычисления геометрических моментов для объема, заключенного в полигональное представление каждой сегментированной ячейки [35]. Мы демонстрируем универсальность нашего метода, используя данные из ассортимента структур на различных стадиях развития внутри слухового пузырька (развивающегося внутреннего уха) эмбрионов рыбок данио.

Рис. 1. Конвейер анализа изображений Origami.

а. Конфокальная флуоресцентная микрофотография Airyscan (проекция максимальной интенсивности (MIP) 35 z-срезов) развивающегося слухового пузырька рыбки данио на 51. 5 часов после оплодотворения. Красный прямоугольник — передняя проекция; желтый ящик — эндолимфатический мешок; голубой прямоугольник — задняя проекция. ROI расширяются рядом — MIP верхнего ряда и отдельные срезы нижнего ряда. Шкала баров: 20 мкм. Синие стрелки отмечают направление апикобазальной полярности (указывая на апикальную сторону). б. Назначение полярности для сегментированных данных; ROI, окружающая переднюю проекцию, была сегментирована (здесь наложена на MIP) с использованием ACME, центроиды были созданы для каждой сегментированной клетки, и из этих центроидов была создана треугольная поверхностная сетка.Векторы нормалей (синие стрелки) к этой поверхностной сетке представляют апико-базальную ось. в. Характеристики формы клеток рассчитывали относительно заданной апико-базальной оси; здесь выделены три примерных ячейки вместе с 3D-рендерингом, показывающим их положение в передней проекции и соответствующие показатели формы в таблице.

https://doi.org/10. 1371/journal.pcbi.1009063.g001

Дизайн и внедрение

Конвейеру Origami предшествует этап сегментации на основе мембраны.Для этого мы использовали программное обеспечение сегментации ACME с открытым исходным кодом [14]. Сегментированные данные подвергаются двум основным операциям в Origami; назначение вектора направления эпителиальной полярности (рис. 1B) и выделение признаков формы (рис. 1C).

Назначение направления полярности отдельным ячейкам

Чтобы вычислить особенности формы клеток, изменяющиеся по направлениям, такие как асимметрия (асимметрия клеточной массы), а также продольное и поперечное распространение, положение сегментированных клеток должно быть найдено в трехмерном пространстве вдоль биологически значимой оси — мы выбрали известную апико-базальную ось. клетки.Складчатый эпителий был реконструирован in silico в виде тонкой «корочки» — сетки с открытой поверхностью, которая триангулирует центроиды сегментированных клеток в трехмерном пространстве с использованием алгоритма корки [36,37] (рис. 1В). Метод Коры вычисляет сетку поверхности из неорганизованных точек — центроидов ячеек в нашем случае, используя диаграмму Вороного центроидов ячеек.

После этого наш автоматизированный метод исправляет дефекты расчетной сетки поверхности, которые могут привести к ошибкам в результирующих векторах направлений.Сетка уточняется путем удаления дубликатов (в вычисляемых вершинах или треугольных гранях) и любых самопересекающихся треугольных граней. Ребра, не являющиеся многообразиями, то есть ребра, общие для более чем двух треугольных граней, повторно объединяются в сетку многообразия с использованием алгоритма поворота шара [38,39].

Треугольные грани уточненной сетки упорядочены, поэтому, применяя правило правой руки при создании векторов нормалей к поверхностной сетке, все эти векторы указывают на одну и ту же сторону репрезентации сетки эпителиальной поверхности (рис. 1В).На данный момент все еще есть две возможные противоположные ориентации для каждого рассчитанного вектора — обращенные к апикальной или базальной стороне эпителия, с разницей только в знаке. В развивающихся слуховых пузырьках рыбок данио апикальная поверхность эпителия обращена к заполненному жидкостью просвету пузырька [2,8,40]. Мы использовали это предварительное знание, чтобы сообщить ориентацию векторов, установив значение двоичного параметра, определяющего ориентацию, на «внутрь», чтобы они указывали на точку схождения, которая приходится на сторону криволинейной поверхностной сетки, которая соответствует вершине. (люменальная) сторона эпителия каждой клетки.Когда структура складывается несколько раз в противоположных ориентациях, например, в синтетических данных, созданных для этого исследования, «in» устанавливает векторы направления полярности так, чтобы они указывали на глобальную точку схождения, в нашем случае определяемую кривизной всего синтетического эпителия.

Недосегментация может привести к отсутствию областей или нежелательным отверстиям в треугольной сетке, что приведет к ошибкам при упорядочении треугольных граней. Наш пайплайн пытается исправить эти дыры, обнаруживая их, а затем перестраивая, где это возможно. Дыры при обнаружении помечаются как предупреждение пользователям о возможных ошибках в выводе. Векторы нормали к реконструированной поверхности представляют собой апико-базальную ось эпителия и генерируются для каждой сегментированной клетки в их центроидном положении (рис. 1B и 1C).

Вычисление элементов формы с использованием трехмерных геометрических моментов

Форма объекта может быть охарактеризована центральными геометрическими моментами [41]. Геометрические моменты широко используются в задачах распознавания и классификации объектов [42, 43], поскольку они (i) просты для вычисления, (ii) организуют признаки в порядке возрастания детализации и (iii) могут быть расширены до n измерений.Каждый момент определяется интегралом по объекту (в нашем случае по каждой сегментированной ячейке) монома декартовых координат , где i , j , k ≥ 0, с началом координат в центроид.

В нашем конвейере анализа трехмерные геометрические моменты вычислялись с использованием алгоритма, представленного в [35]. Определяющие непрерывные интегралы точно вычисляются в треугольной сетке поверхности, созданной для каждой отдельной сегментированной ячейки, разделенной на сумму: (1) где каждый тетраэдр T _c определяется треугольником в сетке поверхности и началом координат (центроидом ячейки).Определитель дает ориентированный объем этого тетраэдра, (2)

Определитель с учетом своего знака позволяет применять алгоритм к фигурам любой сложности и топологии. Интеграл в каждом T _c задается замкнутой формулой, включающей только декартовы координаты треугольных вершин.

Геометрические моменты низших порядков имеют простую интуитивную интерпретацию. Нулевой ^-й -й момент порядка обеспечивает объем объекта, здесь отдельной ячейки.Для центральных моментов моменты первого порядка тривиально равны нулю: . Моменты второго порядка соответствуют разбросу (тензору ковариации) распределения. Таким образом, проекция массы каждой клетки вдоль соответствующего вектора полярности представляет «разброс» как дисперсию массы «продольно» (вдоль апико-базальной оси) и «поперечно» (вдоль эпителиальной плоскости). Это позволило нам определить, были ли клетки более или менее столбчатыми (высокие клетки) или плоскоклеточными (плоские клетки) по форме. Моменты третьего порядка представляют «асимметрию», то есть отклонение от симметрии.В нашем конвейере асимметрия измерялась вдоль вектора направления полярности в апикально-базальном направлении, при этом положительные значения асимметрии указывали на сужение апикальной клетки и/или базальную релаксацию, а отрицательные значения указывали на сужение базальной клетки и/или апикальное расширение. Нулевое значение указывает на отсутствие перекоса. Кроме того, сферичность каждой ячейки рассчитывалась как отношение площади поверхности клетки к площади поверхности сферы того же объема, что и ячейка [44], от 0 для клетки очень неправильной формы до 1 для идеальной сферы. .

Результаты

Оценка вычисленного вектора направления полярности ячейки

Чтобы оценить вычисленные векторы направления, обозначающие клеточную полярность, мы создали трехмерные синтетические данные, представляющие изогнутые складчатые эпителии с различной степенью кривизны и высотой складчатого пика в двух противоположных ориентациях (текст S1 и рис. 2A). Чтобы отразить реальные условия флуоресцентной визуализации in vivo , эти синтетические данные были искажены тремя инкрементными уровнями гауссовского и пуассоновского шума (текст S1 и рис. 2A).Используя синтетические данные, были оценены два типа ошибок в вычисленных векторах направления полярности: (1) ошибка переключения ориентации, измеренная как процент векторов полярности с противоположной ориентацией (противоположным знаком) истинной полярности (текст S1), и (2) точность направления, измеряемая как средний угол отклонения между векторами полярности, созданными Origami, правильно ориентированными, и истинной полярностью.

Рис. 2. Оценка назначения полярности.

а.Поверхностные сетки синтетического эпителия для проверки конвейера анализа Origami. Наряду с этим 3D-рендеринг одного из синтетических эпителиев (вверху) и одного 2D-среза через него (внизу). Каждый том изображения был искажен тремя уровнями шума. б. Взаимосвязь между геометрией поверхности/шумом и качеством сегментации. Столбики погрешностей представляют собой стандартное отклонение. Попарные сравнения Тьюки со значимыми значениями, отмеченными звездочками: оценка игральной кости при радиусе кривизны 200 мкм (1000 пикселей) по сравнению с показателем при 106 мкм (530 пикселей) – p = 0.0004, балл Dice при самом высоком уровне шума по сравнению с самым низким: p = 0,0045. в. Влияние качества сегментации на ошибки при переключении ориентации (слева) и смещении направления в вычисленных векторах полярности (полосы ошибок, выделенные серым цветом, представляют собой стандартное отклонение). Пунктирные линии представляют собой квадратичное и линейное приближение к данным соответственно. д. Плотность вероятности ошибок в направлении полярности в реальных данных флуоресценции эмбрионов рыбок данио. Каждая точка представляет собой процентную ошибку для трехмерного сегментированного объема (n = 27; всего 949 сегментированных ячеек на всех изображениях).Пунктирная линия показывает среднюю ошибку в наборе данных (<4%). е. Чувствительность показателей формы клеток к ошибкам ориентации полярности. Точки данных на графиках отображаются тем же цветом, что и соответствующая синтетическая ячейка рядом. парные сравнения Тьюки со значимыми значениями, отмеченными звездочками; Продольный разброс: 1–2 p = 0,039, 1–3 p < 0,0001, 2–3 p < 0,0001; Поперечный разброс: 1–2 p < 0,0001, 1–3 p < 0.0001, 2–3 р < 0,0001; Асимметрия: 1–2 p < 0,0001, 1–3 p < 0,0001, 2–3 p < 0,0001.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009063.g002

Из двух проанализированных аспектов геометрии поверхности высота изогнутого пика (в двух противоположных направлениях) не вносила значительного вклада в ошибки переключения ориентации (линейная регрессия; p = 0,86, R ² = -0,04). Однако больший радиус кривизны эпителия (более плоский эпителиальный лист) коррелировал с ошибками переключения ориентации, хотя и с небольшим эффектом 0. 08% увеличение на каждый 1 мкм (5 пикселей) увеличение радиуса кривизны (линейная регрессия; p = 0,042, R ² = 0,12, эффект) и более низкое качество сегментации на выходе из ACME (линейная регрессия p < 0,001, R ² = 0,46; рис. 2B), рассчитанный как оценка Dice. Это означало снижение оценки Dice на 0,2% на каждый 1 мкм (5 пикселей) увеличения радиуса кривизны. Эта корреляция может быть связана со сниженной способностью ACME сегментировать плоские плоскоклеточные клетки в эпителии, ориентированном в основном вдоль латеральной ( xy ) плоскости в данных с анизотропным воксельным разрешением (здесь смоделировано с использованием анизотропной функции рассеяния точки (PSF)) .Мы обнаружили корреляцию между шумом, примененным к синтетическим изображениям, и ошибками при переключении ориентации обеих полярностей (ANOVA: p ≈ 0,001; контрасты Тьюки показали увеличение ошибок на 11,3% при самом высоком уровне шума по сравнению с самым низким уровнем шума: p ). = 0,0039) и результат сегментации (ANOVA: p <0,01; контрасты Тьюки показали снижение оценки Дайса на 16,3% при самом высоком уровне шума по сравнению с самым низким применяемым уровнем шума: p = 0,0045). Качество сегментации, в свою очередь, влияло на переключение полярности с ошибками менее 1.5% при баллах Дайса выше 0,8, но увеличивается при дальнейшем снижении баллов Дайса (полиномиальная регрессия; первый порядок: p <0,001, размер эффекта = -28,78; второй порядок: p <0,01, размер эффекта = 16,26 ; рис. 2С). Сравнение многих доступных алгоритмов сегментации при проверке флуоресцентными изображениями несвернутых структур, таких как зародыши нематод на ранней стадии [16] или корни растений [18], показало, что баллы Дайса превышают 80%, что свидетельствует о хорошей производительности в реальных экспериментальных условиях. условия.

Количественная точность направления была оценена в синтетических данных, для которых, в отличие от данных реальных флуоресцентных изображений, можно было получить надежную базовую истину из известных функций подстилающей поверхности. По сравнению с наземными данными полярности, общее смещение 10,6° ± 15,5° (среднее ± стандартное) было измерено из всего нашего синтетического набора данных. Так же, как и для ошибки переключения ориентации полярности, высота свернутого пика не влияла на точность направления полярности (линейная регрессия; p = 0.39, R ² = -0,01), но наблюдался небольшой эффект кривизны эпителия с дополнительным смещением на 0,06° на каждый 1 мкм (5 пикселей) увеличения радиуса кривизны эпителия (линейная регрессия; р = 0,005, R ² = 0,24). При самом высоком уровне шума ошибки ориентации полярности имели смещение на 6,6° больше, чем при самом низком уровне шума (контрасты Тьюки; p = 0,003). Был также отрицательный линейный эффект качества сегментации с 2.Смещение на 9° прогнозировалось для каждых 10% снижения оценки Dice (линейная регрессия; p < 0,0001, R ² = 0,53; рис. 2C).

Далее мы проверили влияние таких ошибок в точности направления на метрики формы, изменяющиеся в направлении, вычисленные путем применения направленного шума — со средним значением, равным измеренной средней ошибке выше — к векторам полярности трех ячеек в качестве примера, демонстрирующих экстремальные особенности формы из синтетического набор данных и вычисленные метрики формы в зависимости от направления для каждого нового смещенного вектора полярности ( n = 50; рис. 2E).Результирующие вычисленные метрики формы по-прежнему могут успешно различать три ячейки, показывая, что ошибки точности направления (исключая ошибки изменения ориентации) не должны неблагоприятно влиять на вычисленные метрики формы. С другой стороны, ошибки переворота ориентации будут влиять на метрики формы, но, как показано выше, эти ошибки прогнозируются небольшими для хорошо сегментированного объема изображения и могут быть легко идентифицированы при визуальном осмотре и при необходимости исправлены с помощью конвейера Origami.

Кроме того, ошибки переключения ориентации были количественно оценены по данным реальной флуоресцентной микроскопии светового листа структур в развивающихся отических пузырьках рыбок данио (рис. 1 и 3). Для этого клетки, которым была присвоена неправильная ориентация вдоль апико-базальной оси, то есть обращенные к базальной поверхности, а не к апикальной поверхности, были идентифицированы с помощью визуальной оценки в конвейере Оригами, показывая ошибки в 3,65% из n = 949 клеток. проанализированы (рис. 2D).

Рис. 3. Сравнение динамики формы развивающихся структур внутреннего уха рыбок данио.

Строки представляют каждый анализируемый момент времени. Данные, выделенные синим цветом, представляют собой клетки из AP, зеленые представляют собой клетки из PP, а пурпурный цвет представляют собой ES. а. Двойные диаграммы линейного дискриминационного анализа (LDA) иллюстрируют многомерную кластеризацию данных: данные из AP и PP показывают значительное перекрытие, указывающее на схожие сигнатуры формы, в то время как данные из ES показывают меньшее совпадение с первым. б. Схематические иллюстрации сигнатур формы клеток в проанализированные моменты времени, показывающие клетки в ES, имеющие перекос в направлении, противоположном таковым в проекциях, и имеющие менее округлые формы.Стрелки указывают на апико-базальную полярность. в. Графики, показывающие различия в асимметрии и сферичности между структурами в проанализированные моменты времени. Желтые точки с линиями ошибок представляют собой среднее значение и стандартное отклонение для данных. p значения для парных сравнений взяты из таблицы 1.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009063.g003

Доказательство принципа: понимание динамики формы клеток во время эпителиального морфогенеза во внутреннем ухе рыбок данио

Для дальнейшего подтверждения нашего метода мы использовали Origami для характеристики динамики формы клеток, участвующих в формировании различных структур в слуховом пузырьке эмбриона рыбки данио (рис. 1 и 3).Мы проанализировали данные флуоресцентного изображения светового листа из передней эпителиальной проекции (AP) для развивающейся системы полукружных каналов вместе с эндолимфатическим мешком (ES) в трех временных точках развития: 42,5 часа после оплодотворения (hpf) (момент времени 1) , 44,5 hpf (момент времени 2) и 50,5 hpf (момент времени 3), используя трех разных рыб для каждого момента времени. Мы также проанализировали заднюю эпителиальную проекцию (PP), структуру, аналогичную AP, но которая развивается позже [40], в моменты времени, эквивалентные таковым для AP (46. 5 л.с., 50,5 л.с. и 60,5 л.с.). AP и PP представляют собой пальцевидные проекции эпителия, которые перемещаются в просвет везикулы, при этом апикальная сторона клетки находится снаружи изогнутой проекционной поверхности [40]. Напротив, ES формируется как инвагинация из дорсального отического эпителия, при этом суженные апикальные поверхности клеток выстилают узкий просвет результирующего короткого протока [8,45,46]. Поскольку ES формируется за счет деформации эпителиального листка с полярностью, противоположной полярности эпителиальных выступов, мы ожидаем, что клетки в ES и выступах будут демонстрировать значительные различия в форме клеток.Наоборот, мы не ожидаем существенных различий в форме клеток между клетками AP и PP, которые формируют эквивалентные структуры в развивающемся ухе.

Для каждой структуры были вычислены следующие атрибуты формы на уровне одной ячейки: площадь поверхности, сферичность, продольное распространение, поперечное распространение и асимметрия. Поскольку объем и площадь поверхности показывают высокую коллинеарность в наших данных (коэффициент корреляции Пирсона = 0,98, 95% доверительные интервалы = [0,977, 0,984]), объем клеток был исключен из дальнейшего анализа. Хотя изображения включали клетки нескладывающегося эпителия вокруг интересующих развивающихся структур, анализировались только клетки складчатого эпителия. Многофакторный анализ (пакет {MANOVA.RM} [47] в R [v 4.0.0]) зависимости атрибутов формы клеток от эпителиальной структуры, из которой они получены, в разные моменты времени показал значительную разницу между тремя структурами. в первые два периода развития (статистика типа Вальда; p = 0,035 (повторная выборка p = 0.001) в момент времени 1 и p < 0,001 (после повторной выборки p < 0,001) в момент времени 2), но не в последний проанализированный момент времени ( p = 0,706 ( после повторной выборки p = 0,038)) для всех атрибуты формы. Апостериорные контрасты Тьюки показали, что клетки в эндолимфатическом мешке демонстрировали значительно отличающуюся динамику формы от клеток в обеих проекциях (ES-AP p = 0,006, PP-ES p = 0,012 в момент времени 1; ES-AP р = 0. 0002, PP — ES p = 0,0002 в момент времени 2, но ES — AP p = 0,192, PP — ES p = 0,116 в момент времени 3). Не было существенной разницы в сигнатуре формы клеток между клетками в передней и задней проекциях (контрасты Тьюки; PP — AP p = 0,997 в момент времени 1; PP — AP p = 0,999 в момент времени 2 и PP — 0,999). AP p = 0,896 в момент времени 3). Эти результаты показывают, что включенные признаки формы клеток были более похожими, чем разными для клеток из структур в третий проанализированный момент времени.

Из анализируемых признаков: асимметрия (критерий Крускала-Уоллиса; p = 0,008 во время 1, p = 0,004 во время 2 и p < 0,0001 во время 3), сферичность (критерий Крускала-Уоллиса; p p = 0,004 во время 2) < 0,001 во время 1, p = 0,00012 во время 2 и p < 0,001 во время 3) и площадь поверхности (критерий Крускала-Уоллиса; p < 0,001 во время 1, p < 1 во время 0,00067) 2 и p = 0,018 во время 3) описаны значительные различия в форме клеток во всех трех проанализированных временных точках; клетки эндолимфатического мешка характеризовались положительными значениями асимметрии, меньшими значениями сферичности и большей площадью поверхности по сравнению с клетками в обеих проекциях, которые показывают отрицательные значения асимметрии (табл. 1 и рис. 3).

Различия в площади поверхности, вероятно, связаны с различиями в сферичности клеток в трех структурах, но не в размерах, поскольку поперечное и продольное распространение не выявило существенных различий.

Доступность и будущие направления

Origami можно бесплатно загрузить с https://github.com/cistib/origami. Он реализован в MATLAB (совместимость с версией 2018b и выше) и включает дополнительные инструменты для визуализации метрик формы клеток из сложных складчатых эпителиев на уровне одной клетки.Инструкции по установке и использованию прилагаются к программному обеспечению.

Наше программное обеспечение может принимать предварительно сегментированные данные, что делает его совместимым с алгоритмами сегментации по выбору пользователя, потенциально позволяя анализировать данные, полученные с использованием других методов трехмерной визуализации, таких как томография. Сегментированные данные должны точно отражать форму клетки, поэтому выбор метода визуализации, который может точно определить трехмерную форму клетки наряду с сегментацией на основе мембраны или цитоплазмы, имеет решающее значение.

Мы использовали априорные знания об организации слухового эпителия, чтобы сообщить ориентацию апико-базальной оси эпителиального листка лицом к просвету слухового пузырька [2,8,40]. Важно знать организацию апико-базальной оси клеток внутри любой новой структуры, изучаемой для применения Оригами, где параметр, определяющий ориентацию, может быть установлен таким образом, чтобы всегда быть «внутри» или «наружу» в зависимости от того, полярность или нет. вектор направления должен указывать на внутреннюю или внешнюю поверхность изогнутой конструкции.Мы также предположили, что отдельные клетки не нарушают эту организацию, так как это невозможно обнаружить без дополнительных меток, специфичных для полярности. В таком случае векторы полярности из нашего анализа могут быть дополнены информацией из маркировки, специфичной для полярности, для отслеживания такого поведения. Кроме того, для вычисления признаков формы вдоль альтернативной оси полярности конвейер может принимать предварительно назначенную полярность в виде списка векторов для конкретной ячейки.

Мы ожидаем, что Origami будет применяться для изучения широкого спектра морфогенетических процессов и внесет свой вклад в наше понимание лежащих в их основе биомеханических процессов.

Быстрое прототипирование произвольного 2D- и 3D-каркаса ДНК-оригами | Исследование нуклеиновых кислот

Аннотация

Wireframe DNA origami теперь можно программировать автоматически сверху вниз с использованием простой целевой геометрии каркаса или сеток в 2D и 3D, используя либо жесткую связку из шести спиралей (6HB), либо более подходящую связку из двух спиралей (DX ) края. Хотя эти сборки имеют множество применений в производстве наноразмерных материалов из-за их наноразмерной пространственной адресации и высокой степени настройки, пока не существует простого в использовании программного обеспечения с графическим пользовательским интерфейсом для развертывания этих алгоритмических подходов в одном автономном интерфейсе. Кроме того, последовательное проектирование сверху вниз 3D-объектов на основе DX, ранее поддерживаемое DAEDALUS, было ограничено дискретными длинами ребер и одинаковыми углами вершин, что ограничивало объем объектов, которые можно проектировать. Здесь мы представляем пакет программного обеспечения с открытым исходным кодом ATHENA с графическим пользовательским интерфейсом, который автоматически отображает маршрутизацию одноцепочечных каркасов ДНК и последовательности основных цепей для любого целевого каркаса ДНК-оригами с использованием ребер DX или 6HB, включая неправильные, асимметричные полиэдры на основе DX с различные длины ребер и вершин, продемонстрированные экспериментально, что значительно расширяет набор возможных сборок на основе трехмерной ДНК, которые можно спроектировать.ATHENA также позволяет осуществлять внешнее редактирование последовательностей с использованием caDNAno, что демонстрируется с использованием асимметричного наноразмерного позиционирования наночастиц золота, а также предоставление моделей атомного уровня для молекулярной динамики, грубозернистой динамики с oxDNA и других подходов к моделированию вычислительной химии.

ВВЕДЕНИЕ

Нанотехнология структурной ДНК была задумана в новаторской работе Неда Симана (1), в которой он постулировал, что синтетическая ДНК может быть использована для программирования синтетических материалов с заданными структурными характеристиками нанометрового масштаба.Использование Симаном синтетических олигонуклеотидов привело к получению протяженных, кристаллоподобных самособирающихся материалов на основе ДНК без контроля их общего размера и протяженности. Более двух десятилетий спустя, основываясь на правилах проектирования Симана, Пол Ротемунд представил концепцию ДНК-оригами (2), в которой используется длинный одноцепочечный ДНК-геном фага M13mp18, который он использовал для создания шаблонов от десятков до сотен более коротких комплементарных синтетических ДНК. Нити ДНК, которые самособирались или «сворачивались» с образованием единого дискретного продукта ДНК с высоким выходом. В то время как M13mp18 по-прежнему является наиболее часто используемым каркасом для этой цели, подход Ротемунда в целом применим к любой длине и последовательности каркаса, которые могут быть получены ферментативно (3,4) или бактериально (5,6). Вскоре после изобретения Ротемунда Дуглас и др. (7) применил подход Ротемунда к самостоятельной сборке 3D-объектов на основе аналогичных правил проектирования, а также выпустил широко используемое программное обеспечение с графическим интерфейсом пользователя (GUI) caDNAno (8), чтобы помочь в ручном проектировании этого класса ДНК-оригами, в котором Дуплексы ДНК расположены на параллельных сотовых или квадратных решетках, также называемых «кирпичиками» оригами.В то время как caDNAno оказался чрезвычайно полезным для ручной разводки каркасов и полуавтоматического конструирования последовательностей комплементарных скоб, используемых для самосборки или складывания фигур-мишеней (7–10), он имеет ограниченную полезность для относительно нового класса каркасных сборок ДНК-оригами. которые отображают сложную 2D- и 3D-геометрию с использованием каркасных «сеток», которые могут состоять из одинарных (11–13), двойных (3, 14–16) или шестиспиральных ребер пучка (17–19).

Каркас ДНК-оригами с использованием двойного кроссовера (DX) и двухспирального пучка (2HB) впервые был реализован Yan et al. (14) с самосборкой плиток, которая позже была обобщена до 2D и 3D ДНК-оригами Zhang et al. (15). Бенсон и др. (11) позже воспроизвел полиэдрическую геометрию в ДНК полуавтоматически, используя одиночные дуплексы, а в 2016 году Veneziano et al. (3) продемонстрировал, что геометрия 3D-каркаса, основанная исключительно на ребрах DX, может быть спроектирована полностью автоматически на основе целевой геометрии с использованием DAEDALUS. Однако DAEDALUS был ограничен объектами, состоящими из ребер, длина которых кратна 10.5 п.н. и одинаковые углы при вершине. В 2019 г. Jun et al. продемонстрировал полностью автоматическую процедуру проектирования сложных 2D-каркасов ДНК-оригами без каких-либо ограничений по длине ребра или геометрической симметрии на основе ребер DX, названную PERDIX (16). Вскоре после этого они применили аналогичный принцип проектирования для создания краевых 3D-сборок с шестью спиралями (6HB) (TALOS) (17) и 2D-сборок (METIS) (18), где 2D- и 3D-сборки на основе 6HB показали значительно улучшенные характеристики. механическая жесткость по сравнению с аналогами с кромкой DX.PERDIX, METIS и TALOS также позволили визуализировать значительно более широкие классы асимметричных и сложных геометрий за счет введения непрерывных ребер произвольной длины и вершин, подчеркнув возможности каркасного ДНК-оригами для создания сложных наноразмерных материалов с помощью автоматических процедур проектирования. например, в виде наночастиц субъединичной вакцины (20). Однако на сегодняшний день DAEDALUS по-прежнему не может отображать последовательности ДНК для совершенно произвольных трехмерных многогранников, состоящих из недискретных длин ребер и произвольных углов вершин.Кроме того, никакое интегрированное программное обеспечение с графическим интерфейсом, подобное caDNAno (8), не позволяет легко проектировать последовательности ДНК, необходимые для изготовления любого каркасного объекта оригами на основе DAEDALUS, PERDIX, TALOS или METIS. Adenita (21) — это пакет программного обеспечения с графическим интерфейсом пользователя, который не работает с каркасными сборками 2D или 6HB и опирается на устаревшую версию DAEDALUS, которая ограничена объектами с дискретными длинами ребер и правильными углами вершин.

Чтобы обеспечить полностью автоматизированное проектирование последовательности любой каркасной 2D- или 3D-оригами сборки ДНК с DX- или 6HB-ребрами, с произвольными длинами ребер и углами вершин, здесь мы представляем ATHENA.ATHENA состоит из графического пользовательского интерфейса, который интегрирует эти возможности, а также предлагает фундаментальные алгоритмические усовершенствования, позволяющие использовать произвольные длины и углы ребер для точного проектирования произвольных каркасных объектов, включая асимметричные и неправильные геометрические формы с использованием либо равномерно 6HB (17,18), либо ребер на основе DX ( 3,16). В дополнение к полностью автоматизированному дизайну последовательностей, ATHENA создает выходные файлы, включая структуры всех атомов в формате банка данных белков (PDB) (22) для молекулярной визуализации с использованием таких инструментов, как Visual Molecular Dynamics (VMD) (23) или UCSF Chimera (24). , моделирование молекулярной динамики всех атомов или крупнозернистое моделирование с использованием таких инструментов, как oxDNA (25,26) или mrDNA (27), а также файлы caDNAno для редактирования или модификации конструкций последовательностей для функционализации ДНК-оригами или других целей (28) , а также полные файлы последовательностей для упорядочения цепей основных олигонуклеотидов, необходимых для изготовления с помощью самосборки в одном горшке.Мы проверяем конструкции последовательности для пятиугольных объектов 6HB с использованием атомно-силовой микроскопии (АСМ), просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) и крупнозернистого моделирования oxDNA, а также для асимметричного октаэдра на основе DX с использованием криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ). Мы дополнительно иллюстрируем использование ATHENA для асимметричного двумерного размещения наночастиц золота (AuNP) с разрешением в нанометровом масштабе.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Реализация графического интерфейса

ATHENA — это программное приложение с открытым исходным кодом (GNU GPLv3) с графическим интерфейсом пользователя (https://github. com/lcbb/athena), который выполняет полностью автоматизированный дизайн последовательности 2D- и 3D-каркасных ДНК-оригами объектов на основе ребер на основе DX и 6HB и любого интересующего каркаса одноцепочечной ДНК. ATHENA была реализована на Python с использованием библиотек Qt5. Пакеты внутреннего программного обеспечения PERDIX, DAEDALUS, METIS и TALOS встроены в виде двоичных файлов.

Произвольные длины ребер и вершины в DAEDALUS

Автоматический дизайн последовательности на основе DX для любой целевой трехмерной многогранной геометрии с использованием непрерывных длин ребер и произвольных вершин обеспечивается алгоритмическими достижениями в DAEDALUS.Конструкции с непрерывными ребрами позволяют визуализировать объекты на основе ДНК с использованием непрерывных, произвольных длин ребер и углов вершин, при этом один дуплекс заполняет пробел в каждой вершине. Непарные каркасные нуклеотиды используются для охвата расстояния между 3′- и 5′-концами между входящим и исходящим краями, которые в противном случае были бы смещены из-за нативного поворота ДНК B-формы. Вкратце, алгоритм может обрабатывать произвольные длины ребер и углы вершин для точного проектирования трехмерных каркасных объектов асимметричной и неправильной геометрии, которые будут в центре внимания будущей работы.

Поколение PDB

Программное обеспечение для создания PDB в ATHENA использует узлы уровня оснований нуклеиновых кислот, полученные в результате процедуры маршрутизации, и эти узлы включают информацию о последовательности, маршрутизации и положении каждого основания нуклеиновой кислоты. Первым шагом в создании PDB является маршрутизация информации об узле базового уровня в последовательные нити нуклеиновой кислоты, подходящие для модели всего атома, что выполняется с помощью алгоритма поиска, поскольку каждое основание сопоставляется с вышестоящими, нижестоящими и парными основаниями. в модели.Затем модель всего атома строится по основаниям и по цепям путем преобразования координат эталонной средней базовой структуры нуклеиновой кислоты B-формы в положения узлового уровня. Используемые структуры полностью атомных нуклеиновых кислот взяты из набора параметров 3DNA (29), где координаты основаны на средних структурах ДНК B-формы из Olson et al. (30). Несколько функций преобразования координат ProDy используются во время генерации PDB (31). Области одноцепочечных нуклеиновых кислот не включаются в маршрутизацию на уровне узлов, поэтому непарные координаты интерполируются из ближайших пар оснований выше и ниже по течению с использованием кубической функции Безье, обеспечивая плавный путь от произвольных координат пар оснований.Из-за этой процедуры интерполяции между парами оснований ДНК в вершинах могут возникать стерические конфликты. Для успешного моделирования МД всего атома (32,33) перед стандартными процедурами МД необходима минимизация затронутых участков одноцепочечной ДНК. Предыдущие МД-симуляции всего атома (17, 18, 34) успешно использовали исходные структуры, полученные из DAEDALUS, TALOS и PERDIX соответственно.

Стандартный формат файла PDB (22) имеет несколько давних ограничений для больших атомных структур, в том числе ограничения на количество отдельных цепей или нитей нуклеиновой кислоты (62, с учетом количество остатков или оснований нуклеиновых кислот (9999) и пространственные размеры {-999. 999, 9999,999} в Ангстремах. Это программное обеспечение для создания PDB использует обходные пути для некоторых из этих ограничений. Схема нумерации атомов выше индекса 99 999 использует гибридную схему кодирования с основанием 36, где первый символ является алфавитным с учетом регистра, а следующие четыре символа являются буквенно-цифровыми с основанием 36, что теоретически позволяет использовать более 87 миллионов атомов. Алфавитный первый символ позволяет любому синтаксическому анализатору распознать переход от кодировки base-10 к гибридной кодировке base-36. Схема нумерации остатков над индексом 9999 аналогичным образом допускает >2.Всего 4 миллиона остатков с использованием той же гибридной кодировки base-36. Для более крупных атомных структур, в частности с пространственными размерами, превышающими стандартные ограничения PDB, можно использовать формат файла PDBx/mmCIF (35), но это оставлено для будущей работы. Выходные файлы PDB совместимы с силовыми полями CHARMM для ДНК (36,37), а преобразование в силовые поля AMBER (38) возможно в AmberTools (39).

Материалы

штапельных нитей ДНК-оригами были приобретены в формате 96-луночных планшетов у Integrated DNA Technologies, Inc.в масштабе синтеза 25 нмоль. Штапельные нити очищали стандартным обессоливанием и калибровали до 200 мкМ на основе полного выхода. Штапельные нити смешивали в равных объемах из соответствующих лунок и использовали непосредственно для фолдинга ДНК-оригами без дополнительной очистки. Цепь ДНК, модифицированная 5′-тиоловым модификатором (C6 S-S), была приобретена у Integrated DNA Technologies, Inc. в масштабе синтеза 100 нмоль со стандартным обессоливанием. Вода, не содержащая нуклеаз, была приобретена у Integrated DNA Technologies, Inc. Каркас ДНК длиной 7249 нуклеотидов (M13mp18) был приобретен у Guild BioSciences в концентрации 100 нМ.Каркас ДНК длиной 2520 нуклеотидов (phPB84) был получен в соответствии с протоколом на основе фага (6). 10-кратный буфер TAE был приобретен у Alfa Aesar. Тетрагидрат ацетата магния (для молекулярной биологии) был приобретен у MilliporeSigma. 1× ТАЕ-буфер с 12,5 мМ Mg(OAc) ₂ готовили с 10× ТАЕ-буфером и тетрагидратом ацетата магния. Набор для конъюгации 5 нм OligoREADY AuNP был приобретен у Cytodiagnostics Inc. Pierce DTT (дитиотреитол) был приобретен у ThermoFisher Scientific, а колонки illustra NAP-5 были приобретены у GE Healthcare Life Sciences.

Оригами для самостоятельной сборки

Все двухмерные пятиугольные ДНК-оригами были сложены по одному и тому же протоколу. 5 нМ каркаса ДНК (M13mp18) смешивали с 20 молярными экв. соответствующие нити скоб в 1× ТАЕ-буфере с 12,5 мМ Mg(OAc) ₂ , конечный объем раствора для самосборки составлял 100 мкл. Смесь отжигали в ПЦР-термоциклере: 95°С в течение 2 мин, от 70°С до 45°С со скоростью 0,5°С за 20 мин и от 45°С до 20°С со скоростью 0,5°С за 20 мин. 10 минут.Отожженный раствор был проверен с помощью 1,5% агарозного геля в 1x буфере TAE с 12,5 мМ Mg(OAc) ₂ и 1x SybrSafe. Гели запускали при 60 В, а затем визуализировали в синем свете. Отожженный раствор разбавляли до 500 мкл 1× ТАЕ-буфером с 12,5 мМ Mg(OAc) ₂ и удаляли лишние основные нити с помощью колонок для концентрации со спин-фильтром MWCO = 100 кДа. Очищенный раствор ДНК оригами доводили до желаемых концентраций (5 нМ) для визуализации с помощью АСМ и ПЭМ.

Объект оригами на основе DX был свернут с использованием каркаса ДНК 40 нМ (phPB84) и 20 молярных эквивалентов необходимых основных цепей в буфере 1× TAE с 12 мМ MgCl ₂ .Сворачивающуюся смесь отжигали в термоциклере: 95°С 5 мин, 80°С до 76°С со скоростью 0,8°С/мин, 75°С до 30°С со скоростью 0,42°С/мин. мин и, наконец, 29°С до 25°С со скоростью 0,625°С в мин. Отожженный раствор анализировали в 2,5% агарозном геле в 1x буфере TBE с 12 мМ MgCl ₂ и 1x SybrSafe, запускали при 65 В в холодной комнате и визуализировали в синем свете. После удаления скоб и замены буфера на 1× ТАЭ с 8 мМ MgCl ₂ с использованием Amicon Ultra 0.Колонки со спин-фильтром объемом 5 мл с MWCO = 100 кДа, очищенный свернутый раствор подвергали скринингу с помощью АСМ и крио-ЭМ визуализации.

Получение конъюгата ДНК-AuNP модифицированной ДНК оригами

5′-тиол-модифицированную цепь ДНК (50 мкМ) восстанавливали с помощью DTT (0,1 М) в 0,15 М натрий-фосфатном буфере (рН 8,5) в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем реакционный раствор очищали на колонке Nap-5 для удаления небольших молекул из 5′-цепи тиол-ДНК. Концентрация очищенной 5′-цепи тиол-ДНК была доведена до 25 мкМ в воде, не содержащей нуклеаз, исходя из OD _260 нм .Один флакон с лиофилизированным 5-нм AuNP OligoREADY™ ресуспендировали в 740 мкл не содержащей нуклеазы H ₂ O. К AuNP добавляли 160 мкл очищенной 5′-тиоловой цепи ДНК (25 мкМ) и 100 мкл 1 М NaCl приостановка. Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов. Избыток цепи ДНК затем удаляли из концентрационных колонок с центрифужным фильтром MWCO = 100 кДа, а тем временем конъюгат ДНК-AuNP концентрировали. Концентрацию конъюгата ДНК-AuNP определяли по OD _520 нм .

Конъюгат ДНК-AuNP добавляли к раствору очищенной ДНК оригами (20 нМ) в соотношении 5:1 (AuNP : сайты модификации на оригами), и смеси инкубировали в 1× ТАЕ-буфере с 12,5 мМ Mg( OAc) ₂ при комнатной температуре в течение ночи.

АСМ и ПЭМ изображения

выполняли в «режиме ScanAsyst в жидкости» (Dimension FastScan, Bruker Corporation) с наконечниками ScanAsyst-Fluid+ или SNL-10 (Bruker Inc.). Два микролитра образца (5 нМ) наносили на свежесколотую слюду (Ted Pella Inc.) и от 0,5 до 1,0 мкл NiCl ₂ в концентрации 100 мМ для фиксации наноструктур оригами на поверхности слюды. После ожидания примерно 30 с для адсорбции образца на слюде к образцам добавляли 80 мкл 1× ТАЕ/Mg ²⁺ буфера, а дополнительные 40 мкл того же буфера наносили на наконечник АСМ. Для визуализации с помощью ПЭМ 5 мкл раствора ДНК-оригами (5 нМ) наносили на свежую углеродную пленку, полученную тлеющим разрядом, с медными сетками (CF200H-CU; Electron Microscopy Sciences Inc. , Hatfeld, PA), после чего образцу давали впитаться в поверхность в течение 30 с. После удаления раствора образца с сетки фильтровальной бумагой Whatman 42 сетку помещали на 5 мкл свежеприготовленного 2%-ного формиата уранила с 25 мМ NaOH на 10 с. Оставшийся раствор красителя на сетке удаляли фильтровальной бумагой Whatman 42 и сушили в домашнем вакууме перед визуализацией. Изображение образца было получено на Tecnai FEI с помощью камеры Gatan.

Сбор данных крио-ЭМ и обработка изображений

Triton X-100 добавляли к концентрированным очищенным образцам оригами (∼1.3 мкМ) для конечной концентрации 0,025%. Полученный раствор объемом 3 мкл наносили на медные сетки Quantifoil R2/1 с тлеющим разрядом 300 меш и замораживали в жидком этане с помощью Vitrobot (ThermoFisher Scientific) с 6-секундным блоттингом. Затем сетки визуализировали с помощью телескопа Talos Arctica G2 (ThermoFisher Scientific) с детектором Falcon 3EC, работающего при 200 кВ и увеличении 73 000x (номинальный размер пикселя 2,008 Å), с использованием программного обеспечения EPU (ThermoFisher Scientific). Обработка изображения одной частицы и трехмерная реконструкция для асимметричного октаэдра на основе DX с длиной ребра 63 были выполнены с использованием EMAN2 (40).Все частицы были собраны вручную с помощью e2boxer.py в EMAN2. Первоначальные модели, сгенерированные программным обеспечением ATHENA, были отфильтрованы фильтром нижних частот до 60 Å, чтобы избежать систематической ошибки модели. Следующие шаги были выполнены, как описано ранее (17). Всего для окончательного уточнения асимметричного октаэдра на основе DX с длиной ребра 63 п.н. было использовано 3148 частиц.

Крупномасштабное компьютерное моделирование с использованием oxDNA

Чтобы продемонстрировать применимость сгенерированных ATHENA ДНК-наноструктур для крупнозернистого моделирования oxDNA, мы выполнили молекулярно-динамическое моделирование (МД) с использованием модели oxDNA2 и версии 2 oxDNA.4 программное обеспечение для моделирования (41–44). По сравнению с полноатомным моделированием МД, oxDNA обеспечивает грубое приближение для изучения термодинамических и механических свойств ДНК в более длительных временных масштабах (41,43). Мы исследовали пентагональные объекты на основе 6HB с различной длиной ребра (от 42 до 210 п.н.) в том виде, в каком они были получены экспериментально. Выходные мультимодельные PDB-файлы ATHENA сначала были преобразованы в файловый формат oxDNA с использованием tacoxDNA (45). Все наноструктуры ДНК были смоделированы при концентрации соли 1 М [Na ⁺ ], как было предложено для представления экспериментальных условий (43).После начальной минимизации энергии (2000 шагов) ДНК-объекты уравновешивали в течение 30,3 мкс (10 ⁷ шагов) при 300 К с использованием термостата Ланжевена (коэффициент диффузии 2,5). Затем были смоделированы уравновешенные структуры в течение 0,303 мс (10 ⁸ шагов, временной шаг: 0,1515 пс) при 300 К с использованием Андерсоноподобного термостата Джона (коэффициент диффузии 2,5). Начальные скорости были сгенерированы из максвелловского распределения. Моделирование визуализировали с помощью oxView и анализировали с помощью инструментов анализа oxDNA (44, 46).Среднеквадратичные колебания (RMSF) рассчитывали относительно средней структуры.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В ATHENA 2D- и 3D-целевые геометрии задаются с помощью полигональной сетки поверхности, а в 3D каждое ребро каждой полигональной поверхности представляет собой одно из ребер соседней поверхности. Они предоставляются вручную или через формат файла ASCII, который определяет полигональную сетку, например, формат файла полигона (PLY), STereoLithography (STL) или язык моделирования виртуальной реальности (WRL) с использованием любого количества программ САПР.Затем ATHENA обеспечивает полностью автоматизированный дизайн последовательности 2D- или 3D-каркаса объектов ДНК-оригами, основанных на жестких 6HB или более совместимых кромках 2HB (рис. 1 и дополнительное примечание 1). Файл PLY (дополнительное примечание 2) используется в качестве входных данных для ATHENA из-за его простоты и широкого применения в проектах на основе САПР. Преобразование типов файлов STL в PLY может выполняться с использованием инструментов с открытым исходным кодом и онлайн-конвертеров. Поскольку маршрутизация скаффолда и дизайн скобок основаны на файлах PLY, важно, чтобы каждая вершина, указанная в файле, относилась хотя бы к одной грани, поскольку в противном случае нет возможности провести скаффолд ssDNA через весь целевой объект (17).После ввода входных данных ATHENA предлагает возможность визуализировать целевой 2D- или 3D-каркасный объект, используя затенение поверхности и/или края каркаса, в цветах по умолчанию, которые можно изменить с помощью пользовательских параметров (рис. 1A; i). Масштабирование, вращение и перевод могут быть выбраны как стандартные параметры мыши, а также перспектива по сравнению с ортогональными видами (рис. 1A; iv). ATHENA также предоставляет 37 предопределенных 2D и 55 3D целевых геометрий (рис. 1A; ii и дополнительные примечания 3 и 4).

Рис. 1.

Интерфейс и выходы дизайна ATHENA. ( A ) Снимок экрана графического пользовательского интерфейса с двумя окнами для визуализации целевой геометрии (окно ввода) и выходных данных (окно вывода), таких как цилиндрическая, маршрутная и псевдоатомарная модели. Дополнительные четыре панели предназначены для управления опциями; (i) цветовая схема рендеринга, (ii) целевая геометрия, последовательность каркаса, длина края, тип края, (iii) выходные данные и (iv) управление камерой. ( B ) На основе целевой геометрии DAEDALUS от ATHENA направляет однонитевой каркас по всей геометрии и генерирует несколько выходных данных; цилиндрическая модель, модель маршрутизации, псевдоатомная модель, текстовый файл для основных последовательностей, JSON для caDNAno и PDB для моделирования молекулярной динамики.

Рис. 1.

Интерфейс и выходные данные ATHENA. ( A ) Снимок экрана графического пользовательского интерфейса с двумя окнами для визуализации целевой геометрии (окно ввода) и выходных данных (окно вывода), таких как цилиндрическая, маршрутная и псевдоатомарная модели. Дополнительные четыре панели предназначены для управления опциями; (i) цветовая схема рендеринга, (ii) целевая геометрия, последовательность каркаса, длина края, тип края, (iii) выходные данные и (iv) управление камерой. ( B ) На основе целевой геометрии DAEDALUS от ATHENA направляет однонитевой каркас по всей геометрии и генерирует несколько выходных данных; цилиндрическая модель, модель маршрутизации, псевдоатомная модель, текстовый файл для основных последовательностей, JSON для caDNAno и PDB для моделирования молекулярной динамики.

ATHENA использует M13mp18 в качестве последовательности скаффолда по умолчанию для требуемых длин, меньших или равных 7249 нт; последовательность фага лямбда, если она больше 7250 нуклеотидов и меньше или равна 48502 нуклеотидам; и случайная последовательность, если она больше 48 503 нт. Определяемые пользователем последовательности каркасов также можно импортировать с помощью текстового файла (рис. 1А; ii). В ATHENA есть возможность выбрать тип ребра: двойной кроссовер ДНК (DX или 2HB) или пучок из шести спиралей (6HB), который состоит из каждого ребра 2D- или 3D-каркасных объектов (рис. 1A; ii).Затем можно выполнить полностью автоматизированный дизайн каркаса и последовательности скобок с использованием мотивов DX- (3,16) или 6HB-краев (17,18) либо с каркасом по умолчанию, каркасом одноцепочечной ДНК M13, либо с пользовательским каркасом длины и последовательности, определенными пользователь (рисунок 1A; iii и дополнительный рисунок S1). Кроме того, минимальная длина ребра назначается самому короткому ребру, которое затем используется для масштабирования всех других ребер, определяя длину ребра от 42 п.н. (13,9 нм) до 210 п.н. (71,1 нм) в схеме, что может диапазон от 20 до 200 нм для 2D и от 20 до 100 нм для 3D при использовании каркаса одноцепочечной ДНК M13mp18 (7249 нт).

После завершения процедуры проектирования последовательности в ATHENA отображается цилиндрическое представление, перекрывающееся с целевой геометрией (рис. 1B). В цилиндрической модели каждый край каркасной структуры визуализируется с использованием цилиндра (диаметром 2 нм), который представляет собой двойную спираль ДНК. Маршрутизацию нити и спиральность ДНК можно отобразить с помощью параметров маршрутизации и псевдоатомной модели (рис. 1А; iv). Для модели маршрутизации каждая цепь, включая каркас и скобы, аппроксимируется вектором, представляющим направление цепи ДНК (рис. 1В).Более подробные результаты с двойной спиралью ДНК можно отобразить в псевдоатомной модели, построенной сферами и линиями, представляющими нуклеотиды и основу ДНК соответственно. Для облегчения идентификации каркаса и отдельных скоб для маршрутной и псевдоатомарной моделей построены двухцветные схемы с несколькими цветами. Результирующие выходные данные последовательности также можно экспортировать (рис. 1A; iii) в несколько файлов; электронную таблицу значений, разделенных запятыми (CSV), содержащую основные последовательности, модель всего атома PDB и нотацию объектов JavaScript (JSON) для caDNAno (рис. 1B).Веб-сервер tacoxDNA (45) можно использовать для преобразования файла PDB в соответствующие входные данные для выполнения крупномасштабного моделирования с помощью oxDNA (25, 26). Файл JSON можно импортировать в caDNAno (8) для ручного редактирования базы и олигонуклеотидов для функционализации, например, для редактирования последовательностей, удлинения цепей, удаления и добавления нуклеотидов, а также для изменения положения кроссоверов и разрывов. ATHENA предоставляет информацию о краях целевой структуры, связанных с поперечными сечениями в представлении caDNAno (дополнительный рисунок S2).

Основываясь только на целевой геометрии, последовательности каркаса и типе кромки (DX или 6HB), встроенные алгоритмы проектирования в ATHENA выполняют автоматическую маршрутизацию каркаса и проектирование последовательности скоб, в дополнение к созданию необходимых скобочных прядей, необходимых для экспериментального складывания конструкции. (Фигура 2). PERDIX выполняет полностью автоматизированную маршрутизацию каркасов и проектирование последовательностей скоб для любой 2D-геометрии произвольной формы с использованием исключительно кромок на основе DX, в то время как METIS проектирует любую 2D-геометрию с использованием механически более жестких сот или краев 6HB. DAEDALUS полностью автоматически решает проблему маршрутизации каркаса и проектирования скоб для любой трехмерной многогранной поверхности, используя исключительно ребра на основе DX, тогда как TALOS визуализирует любую трехмерную многогранную поверхность с использованием механически более жестких сотовых ребер, что также требует большей длины каркаса для той же геометрии и размера частиц. TALOS дополнительно предлагает возможность использовать каждый возможный кроссовер между соседними дуплексами ребер 6HB (17), что должно обеспечивать повышенную механическую и ферментативную целостность по сравнению с минимальным количеством одиночных кроссоверов, используемых между любыми двумя ребрами в предыдущих конструкциях сотовых октаэдрических последовательностей (47).

Рис. 2.

Полностью автоматизированное проектирование последовательности 2D- и 3D-каркасных структур ДНК с ребрами на основе DX и 6HB. Масштабные линейки, 50 и 150 нм (увеличенные и уменьшенные изображения АСМ соответственно) для структуры PERDIX (16), 50 и 200 нм (увеличенные и уменьшенные изображения АСМ соответственно) для структуры METIS (18) и 20 нм (крио-ЭМ-изображение) и 5 нм (крио-ЭМ-реконструкция) для DAEDALUS, расширенного в этой работе, и структур TALOS (3,17).

Рис. 2.

Полностью автоматизированное проектирование последовательности 2D- и 3D-каркасных структур ДНК с ребрами на основе DX и 6HB.Масштабные линейки, 50 и 150 нм (увеличенные и уменьшенные изображения АСМ соответственно) для структуры PERDIX (16), 50 и 200 нм (увеличенные и уменьшенные изображения АСМ соответственно) для структуры METIS (18) и 20 нм (крио-ЭМ-изображение) и 5 нм (крио-ЭМ-реконструкция) для DAEDALUS, расширенного в этой работе, и структур TALOS (3,17).

Мы протестировали способность ATHENA генерировать высококачественные каркасные ДНК-структуры оригами, что также позволяет пользователям удобно функционализировать такие структуры с помощью других материалов.Во-первых, чтобы оценить способность ATHENA обрабатывать ребра произвольной длины для асимметричных и нерегулярных объектов на основе DX-ребер, мы разработали асимметричный октаэдр с постоянной длиной ребра и переменными углами при вершинах с ребрами 2HB. Мы использовали введенную пользователем последовательность (phPB84 с 2520 нуклеотидами, дополнительные таблицы S1 и S2) в качестве каркаса. АСМ и крио-ЭМ подтвердили успешную сборку этой структуры с высоким выходом (рисунок 3 и дополнительный рисунок S3), предложив первую демонстрацию этого нового алгоритма проектирования последовательности.Крио-ЭМ-реконструкция асимметричного октаэдра на основе DX с длиной ребра 63 п.н. также показала, что эти неправильные объекты складываются, как предполагалось, без значительных искажений запрограммированных ребер или вершин (рис. 3E).

Рисунок 3.

Проектирование асимметричных и неправильных объектов на основе DX с помощью ATHENA. ( A ) Целевая геометрия и модель маршрутизации асимметричного октаэдра с длиной ребра 63 п.н. ( B ) Электрофорез в агарозном геле для асимметричного октаэдра на основе DX.( C ) АСМ и ( D ) крио-ЭМ изображения асимметричного октаэдра на основе DX с длиной ребра 63 п.н. ( E ) Трехмерная реконструкция асимметричного октаэдра на основе DX с длиной ребра 63 п. н. с использованием крио-ЭМ. Разрешение решаемой структуры составляет 3,3 нм.

Рис. 3.

Проектирование асимметричных и нерегулярных объектов на основе DX с помощью ATHENA. ( A ) Целевая геометрия и модель маршрутизации асимметричного октаэдра с длиной ребра 63 п.н. ( B ) Электрофорез в агарозном геле для асимметричного октаэдра на основе DX.( C ) АСМ и ( D ) крио-ЭМ изображения асимметричного октаэдра на основе DX с длиной ребра 63 п.н. ( E ) Трехмерная реконструкция асимметричного октаэдра на основе DX с длиной ребра 63 п.н. с использованием крио-ЭМ. Разрешение решаемой структуры составляет 3,3 нм.

Затем мы создали последовательности основных цепей пяти пятиугольных объектов на основе 6HB (рис. 4 и дополнительные таблицы S3–S8) с различной длиной края от 42 п.н. (13,94 нм) до 210 п.н. (71,06 нм) с помощью ATHENA. ПЭМ и АСМ подтвердили успешную сборку целевых структур, на что указывают точные углы при вершине и высокий выход правильного формирования этих структур (дополнительные рисунки S4 – S13). Крупнозернистое моделирование oxDNA подтвердило высокую структурную стабильность и жесткость структур, особенно с меньшей длиной края (рис. 4). Пользователи могут изменять эти структуры на основе трассировки и псевдоатомарной модели, созданной ATHENA, что позволяет пользователю идентифицировать положение конкретной модификации (выемка или положение выступа). Каждая основная нить была помечена одним и тем же цветом как в псевдоатомной модели, так и в файле caDNAno для удобства идентификации соответствующих основных цепей в файле caDNAno для модификаций.Чтобы продемонстрировать адресность этого хорошо контролируемого материала каркаса и подхода к редактированию, мы модифицировали одну из пятиугольных структур оригами (длина ребра 210 п.н.) для прикрепления AuNP (рис. 5). Следуя процедуре, описанной на дополнительном рисунке S14, мы модифицировали основные нити вокруг вершины этой пятиугольной структуры для позиционирования AuNP. Ручки для конъюгатов ДНК-AuNP располагали либо в трех, либо во всех пяти вершинах пентагональной структуры, а ручки от соседних ребер предназначались для фиксации одной AuNP в вершине. (Рисунок 5C и дополнительные рисунки S15-S17). Изображения ПЭМ показали, что AuNP были успешно размещены в заданных позициях в структуре оригами, что альтернативно могло быть использовано для программирования любого количества неорганических или органических молекул как в 2D, так и в 3D (19).

Рис. 4.

Создание пятиугольных ДНК-оригами из 6HB с ребрами разной длины. ( A ) результаты моделирования oxDNA (центроидные структуры в окраске RMSF) и ( B ) изображения ПЭМ и АСМ для различных длин ребер пятиугольных объектов ДНК длиной 42, 84, 126, 168 и 210 п.н.Масштабные линейки, 25 и 100 нм (увеличение и уменьшение изображения ПЭМ и АСМ соответственно).

Рис. 4.

Создание пятиугольных ДНК-оригами из 6HB с ребрами разной длины. ( A ) результаты моделирования oxDNA (центроидные структуры в окраске RMSF) и ( B ) изображения ПЭМ и АСМ для различных длин ребер пятиугольных объектов ДНК длиной 42, 84, 126, 168 и 210 п. н. Масштабные линейки, 25 и 100 нм (увеличение и уменьшение изображения ПЭМ и АСМ соответственно).

Рисунок 5.

Организация AuNP на пентагональной ДНК-оригами длиной 210 ​​п.н. ( A ) Схемы, показывающие крепление NP в трех или пяти углах. ( B ) Модель маршрутизации и представление caDNAno для пентагональной ДНК-оригами с AuNP. ( C ) ПЭМ-изображения с 2D-оригами пятиугольной ДНК организованных AuNP. Шкала баров, 50 нм.

Рис. 5.

Организация AuNP на пентагональной ДНК-оригами длиной 210 ​​п.н. ( A ) Схемы, показывающие крепление NP в трех или пяти углах.( B ) Модель маршрутизации и представление caDNAno для пентагональной ДНК-оригами с AuNP. ( C ) ПЭМ-изображения с 2D-оригами пятиугольной ДНК организованных AuNP. Шкала баров, 50 нм.

В совокупности предыдущие результаты показывают, что ATHENA предлагает унифицированную программную среду для полностью автоматического нисходящего геометрического проектирования произвольных каркасных конструкций оригами, включая впервые полностью асимметричные каркасные конструкции 2HB, реализованные с помощью нового алгоритма, который обеспечивает непрерывную кромку. длины и произвольные углы вершин, которые нельзя обработать с помощью оригинальной версии DAEDALUS (3).Объекты, сложенные и модифицированные с использованием моделей, созданных ATHENA, демонстрируют надежность и простоту использования этого интерфейса, предлагая универсальный инструмент проектирования для широкого спектра 2D- и 3D-каркасных объектов ДНК-оригами.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ДАННЫЕ

Дополнительные данные доступны на сайте NAR Online.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Национальный научный фонд [CCF-1956054, CCF-1564025, CBET-1729397]; Управление военно-морских исследований [N00014-17-1-2609, N00014-13-1-0664, N00014-16-1-2506]; Армейская субнаграда ICB [KK1954]; Т.Дж. выражает благодарность Фонду Александра фон Гумбольдта за финансовую поддержку через исследовательскую стипендию Федора-Лайнена. Финансирование платы за открытый доступ: Национальный научный фонд [CCF-1956054, CCF-1564025, CBET-1729397]; Управление военно-морских исследований [N00014-17-1-2609, N00014-13-1-0664, N00014-16-1-2506]; Армейская субнаграда ICB [KK1954].

Заявление о конфликте интересов . Ни один не заявил.

Примечания

Текущий адрес: Уильям П. Брикер, кафедра химической и биологической инженерии, Университет Нью-Мексико, Альбукерке, Нью-Мексико, 87131, США.

ССЫЛКИ

Seeman

N.C.

Соединения и решетки нуклеиновых кислот

Ж. Теор. биол.

1982

99

237

247

Ротемунд

П.В.К.

Сворачивание ДНК для создания наноформ и узоров

Природа

2006

440

297

302

Венециано

Р.

RATANALERT

S.

S.

ZHANG

K.

K.

ZHANG

F.

yan

H.

CHIU

W.

CARTE

M.

Дизайнерские наноразмерные сборки ДНК, запрограммированные сверху вниз

Наука

2016

352

1534

1534

Veneziano

R.

Shepherd

T.R.

RATANALERT

S.

S.

BELLU

L.

TAO

C.

,

C.

,

CARTE

M.

in vitro Синтез одноцепочечной ДНК ДНК на

науч. Респ.

2018

8

6548

Praetorius

F.

Kick

B.

Behler

K.L.

Хонеманн

М.Н.

Веустер-Ботц

Д.

Dietz

H.

Биотехнологическое массовое производство ДНК оригами

Природа

2017

552

84

87

Пастух

Т.Р.

Du

R.R.

Huang

H.

Wamhoff

E.-C.

Bathe

M.

Биопродукция чистой одноцепочечной ДНК размером в тысячу оснований

науч. Респ.

2019

9

6121

Дуглас

С.М.

Dietz

H.

LEDL

T.

Högberg

B.

B.

GRAF

F.

SHIH

Вт.м.

Самосборка ДНК в наноразмерные трехмерные формы

Природа

2009

459

414

418

Дуглас

С.М.

Мраморный камень

А.Х.

Тирапиттаянон

С.

Васкес

А.

Церковь

Г.М.

Ши

В.М.

Быстрое прототипирование трехмерных ДНК-оригами с помощью caDNAno

Нуклеин. Кислоты. Рез.

2009

37

5001

5006

Дитц

Х.

Дуглас

С.М.

Ши

В.М.

Сворачивание ДНК в скрученные и изогнутые наноформы

Наука

2009

325

725

730

Castro

C.E.

Kilchherr

F.

Kim

D.-N.

Шиао

Э.Л.

Wauer

T.

Wortmann

P.

Bathe

M.

Dietz

H.

Праймер для ДНК-оригами

Нац. Методы

2011

8

221

229

Benson

E.

Mohammed

A.

Gardell

J.

Masich

S.

CCEIZLER

E.

ORPONEN

стр.

Högberg

B.

Визуализация ДНК многогранных сеток в наномасштабе

Природа

2015

523

441

444

Benson

E.

Mohammed

A.

Bosco

A.

Teixeira

A.I.

Orponen

P.

Högberg

B.

Компьютерное производство каркасных наноструктур ДНК из плоских сеток

Анжю. хим. Междунар. Эд.

2016

55

8869

8872

Мэттис

М.

Агарвал

Н.П.

Шмидт

Т.Л.

Дизайн и синтез триангулированных связок ДНК оригами

Нано Летт.

2016

16

2108

2113

Ян

Х.

Парк

С.Х.

Финкельштейн

Г.

Райф

Дж.Х.

ЛаБеан

Т.H.

Самосборка белковых массивов и высокопроводящих нанопроводов на основе ДНК-шаблона

Наука

2003

301

1882

1884

Чжан

F.

jiang

S.

Â

,

,

S.

LI

Y.

MAO

C.

LIU

Y.

Yan

H.

Сложные каркасные ДНК-оригами наноструктуры с вершинами многоплечевого соединения

Нац. нанотехнологии.

2015

10

779

784

июня

г.

Чжан

F.

F.

T.

,

S.

qi

x.

yan

H.

Bathe

M.

Автономно разработанное двухмерное ДНК-оригами произвольной формы

науч. Доп.

2019

5

eaav0655

Июн

Х.

Пастух

Т.Р.

Чжан

К.

Брикер

В.П.

Li

S.

Chiu

W.

Bathe

M.

Автоматизированное проектирование последовательности трехмерных многогранных каркасных ДНК-оригами 09 909

АКС Нано

2019

13

2083

2093

Июн

Х.

Wang

X.

William

B.

Bathe

M.

Автоматизированный дизайн последовательности двухмерного каркаса ДНК оригами с 0009 ребрами.

Нац. коммун.

2019

10

5419

Вамхофф

Э.-К.

Banal

J.

Bricker

W.

Shepherd

T.

Parsons

M.

Veneziano

R.

R.

Conee

M.

М.

июня

H.

Wang

x.

,

CARTE

M.

Программирование структурированных ДНК Сборки для зондового биофизического процессы

год. Преподобный Биофиз.

2019

48

395

419

Венециано

Р.

Мойер

Т.Дж.

Камень

М.Б.

Вамхофф

Э.-К.

Рид

Б.Дж.

Мукерджи

С.

Шеперд

Т.Р.

Das

J.

Schief

W.R.

Irvine

D.J.

Роль наноразмерной организации антигена в активации В-клеток, исследованная с использованием ДНК-оригами

Нац. нанотехнологии.

2020

15

716

723

де Льяно

Э.

Мяо

Х.

Ахмади

Ю.

Уилсон

А.Дж.

Beeby

M.

Viola

I.

Barisic

I.

Adenita: интерактивное 3D моделирование и визуализация наноструктур ДНК 9009 .

Нуклеин. Кислоты. Рез.

2020

48

8269

8275

Берман

Х.M.

Westbrook

J.

Feng

Z.

Gilliland

G.

Bhat

T.N.

Вайсиг

Х.

Шиндялов

И.Н.

Борн

Ч.П.

Банк данных о белках

Рез. нуклеиновых кислот.

2000

28

235

242

Хамфри

В.

Далке

А.

Schulten

K.

VMD: визуальная молекулярная динамика

Дж. Мол. График

1996

14

33

38

Петтерсен

Э.Ф.

Годдард

Т.Д.

Хуан

К.С.

Диван

Г.С.

Гринблатт

Д.М.

Мэн

ЕС

Феррин

Т.Е.

Химера UCSF — система визуализации для поисковых исследований и анализа

Дж. Вычисл. хим.

2004

25

1605

1612

Оулдридж

Т.Е.

Луи

А.А.

Дойе

J.P.K.

Структурные, механические и термодинамические свойства крупнозернистой модели ДНК

J. Chem. физ.

2011

134

085101

Снодин

Б.Е.К.

Рандиси

Ф.

Мосайеби

М.

Шульц

П.

Шрек

Романо

Ф.

Олдридж

Т.Е.

Цуканов

Р.

Нир

Э.

Луис

А.А.

Внедрение улучшенных структурных свойств и солевой зависимости в крупнозернистую модель ДНК

J. Chem. физ.

2015

142

234901

Maffeo

C.

Aksimentiev

A.

MrDNA: модель с несколькими разрешениями для предсказания структуры и динамики систем ДНК

Рез. нуклеиновых кислот.

2020

48

5135

5146

Ли

Дж.Ю.

Ли

Дж.Г.

Юн

Г.

Ли

К.

Ким

Ю.-Дж.

Ким

К.С.

Ким

Т.Х.

Ким

Д.-Н.

Быстрый вычислительный анализ сборок ДНК-оригами с разрешением, близким к атомному

АКС Нано

2021

15

1002

1015

Лу

X.-J.

3DNA: пакет программного обеспечения для анализа, реконструкции и визуализации трехмерных структур нуклеиновых кислот

Рез. нуклеиновых кислот.

2003

31

5108

5121

Олсон

В.К.

Бансал

М.

Берли

С.К.

Дикерсон

Р.Е.

Gerstein

M.

Harvey

S.C.

Нейдл

С.

Шакед

З.

Стандартная система отсчета для описания геометрии пар оснований нуклеиновых кислот

Дж. Мол. биол.

2001

313

229

237

Bakan

A.

Meireles

LM

Bahar

I.

ProDy: динамика белков, выведенная из теории и экспериментов 9 .

Биоинформатика

2011

27

1575

1577

Yoo

J.

Aksimentiev

A.

In situ структура и динамика ДНК-оригами, определенная с помощью моделирования молекулярной динамики

Проц. Натл. акад. науч. США

2013

110

20099

20104

Maffeo

C.

Yoo

J.

Аксиментьев

A.

Реконструкция ДНК оригами структур de novo с помощью моделирования молекулярной динамики 90 09 .

Рез. нуклеиновых кислот.

2016

44

3013

3019

Кастрюля

К.

Брикер

В.П.

Ratanalert

S.

Bathe

M.

Структура и конформационная динамика наночастиц ДНК — оригами

Рез. нуклеиновых кислот.

2017

45

6284

6298

Вестбрук

Дж.Д.

Фицджеральд

П.М.Д.

Формат PDB, форматы mmCIF и другие форматы данных

Структурная биоинформатика

2005

John Wiley & Sons, Ltd

159

179

Foloppe

N.

A.D.M.

Полноатомное эмпирическое силовое поле для нуклеиновых кислот. I. Оптимизация параметров на основе данных о малых молекулах и макромолекулярных мишенях в конденсированной фазе

Дж. Вычисл. хим.

2000

21

86

104

МакКерелл

Н.Э.

Банавали

Н.К.

Полноатомное эмпирическое силовое поле для нуклеиновых кислот: II. Приложение к моделированию молекулярной динамики ДНК и РНК в растворе

Дж. Вычисл. хим.

2000

21

105

120

Галиндо-Мурильо

Р.

robertson

j.c.

Zgarbová

Zgarbová

м.

ŠPONER

J.

J.

,

М.

Jurečka

стр.

Chatham

T.E.

Оценка текущего состояния модификаций янтарного силового поля для ДНК

J. Chem. Теория вычисл.

2016

12

4114

4127

Кейс

D.А.

Актульга

Х.М.

Белфон

К.

Бен-Шалом

И.Ю.

Брозелл

С.Р.

Cerutti

D.S.

Cheatham

T.E.

Крузейро

V.W.D.

Дарден

Т.А.

Герцог

Р.Э.

Янтарный 2021

2021

Сан-Франциско

Калифорнийский университет

Tang

G.

PENG

L.

,

PR

MANN

DS

DS

Jiang

W.

Rees

I.

Людтке

SJ

EMAN2: расширяемый пакет обработки изображений для электронной микроскопии

Дж. Структура. биол.

2007

157

38

46

Шульц

П.

Романо

Ф.

Олдридж

Т.Е.

Rovigatti

L.

Doye

J.P.K.

Луи

А.А.

Зависимая от последовательности термодинамика крупнозернистой модели ДНК

J. Chem. физ.

2012

137

135101

Ровигатти

Л.

Шульц

П.

Регул

И.Z.

Romano

F.

Сравнение подходов к распараллеливанию в моделировании молекулярной динамики на графических процессорах

Дж. Вычисл. хим.

2015

36

1

8

Дойе

J.P.K.

Fowler

H.

Prešern

D.

Bohlin

J.

Rovigatti

L.

Romano

F.

Шульц

П.

Вонг

К.К.

Луи

А.А.

Шрек

Дж.С.

Крупнозернистая модель oxDNA как инструмент для моделирования ДНК-оригами

2020

POPPLETON

E.

RoMero

R

R.

Mallya

A.

Rovigatti

L.

ŠULC

P.

OxDNA.org: общедоступный веб-сервер для грубого моделирования наноструктур ДНК и РНК

Рез. нуклеиновых кислот.

2021

49

W491

W498

SUMA

A.

A.

E.

Matthies

м.

м.

,

ŠULC

стр.

Romano

F.

Louis

A.A.

Дойе

Дж.П.К.

Micheletti

C.

Rovigatti

L.

TacoxDNA: удобный веб-сервер для моделирования сложных структур ДНК, от отдельных нитей до оригами

Дж. Вычисл. хим.

2019

40

2586

2595

Попплтон

Э.

Болин

Дж.

Маттис

М.

Шарма

С.

Zhang

F.

Šulc

P.

Проектирование, оптимизация и анализ больших наноструктур ДНК и РНК посредством интерактивной визуализации, редактирования и молекулярного моделирования

Рез. нуклеиновых кислот.

2020

48

E72

Tian

Y.

Wang

T.

LIU

W.

xin

H.L.

LI

H.

Ке

Ю.

Ши

В.М.

Gang

O.

Предписанные кластерные архитектуры наночастиц и низкоразмерные массивы, построенные с использованием каркасов оригами из октаэдрической ДНК

Нац. нанотехнологии.

2015

10

637

644

© Автор(ы), 2021 г. Опубликовано Oxford University Press от имени Nucleic Acids Research.